免疫组化简单操作步骤及简单分析：

特殊试剂：

针对目标分子的一抗（需要针对标本的种属）

免疫组化试剂盒（含三种成分，成分1：内源性过氧化物酶阻断剂， 成分2：反应性增强液，成分3：HRP标记的抗小鼠/IgG聚合物）

DAB显色液（需要提前配制：在配液瓶中，加入底物液1mL（试剂2），再加入浓缩DAB溶液50uL（试剂1），混匀，4度避光保存。

常规试剂：

    二甲苯、无水乙醇，95%乙醇、PBS缓冲液，柠檬酸缓冲液，中性树胶，HE染色液，DAPI等

设备和耗材：

移液器、恒温箱、修复仪、光学显微镜

免疫组化笔、计时器、孵育盒、染色架、粘附载玻片、盖玻片、洗瓶

操作步骤(石蜡包埋）：

(1) 脱蜡和水化：石蜡切片置于新鲜二甲苯中，浸泡10分钟×3次；去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡3分钟×3次；去除多余的液体后，置于95%乙醇中，浸泡3分钟×2次；去除多余的液体后，置于75%乙醇中，浸泡3分钟×2次；蒸馏水冲洗1分钟，置于PBS缓冲液中。（问：为什么要脱蜡？答：因为蜡块会封闭抗原位点，影响染色，所以，样本在染色之前，一定要脱蜡。问：脱蜡的方法是什么？答：一般是二甲苯脱蜡。问：用二甲苯处理后，为什么还用乙醇做梯度洗涤（无水-95%-75%），也就是所谓的水化？答：因为二甲苯已经浸透于组织中，但是二甲苯不溶于水，所以，需要酒精把二甲苯溶解，把二甲苯置换出来）。

(2) 抗原修复:参见一抗说明书。一般是：处理好的切片放入盛有柠檬酸盐(PH 6.0)切片盒，放入微波炉，将微波炉调至中高挡(98℃-100℃)并持续加热10分钟，这期间若有水分损失，可直接加入蒸馏水数次；将切片盒从微波炉取出，自然冷却至室温；(问：为什么要做抗原修复？答：由于样本在福尔马林固定的过程中，蛋白多肽发生交联，部分抗原位点被遮蔽，所以我们做抗原修复，目的是充分暴露相应的抗原位点。 问：抗原修复有几种方法？答：一般有两种方法，热修复和酶消化。常见的是，热修复。热修复指缓冲液【EDTA（pH8.0）或枸橼酸钠缓冲液（0.01M，PH=6】被加热煮沸后，片子放于其中，加热10-15分钟左右）

(3) 阻断内源性过氧化物酶：加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。（问：为什么要做过氧化氢酶阻断？答：因为各种组织中，都含有好多的过氧化氢酶，尤其是红细胞，中性粒细胞等出血的组织，更是富含过氧化氢酶，如果不阻断过氧化氢酶，在显色的时候，过氧化氢酶会和HRP竞争，影响正常显色）

(4) 滴加一抗：根据组织大小，滴加100μL或适量一抗，37℃孵育60分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次（问：稀释浓度如何确定？答：一般根据说明书，比如说明书推荐1：10000，我们做一个浓度梯度，1：10000，1：5000，1：15000，进而确定最佳浓度。若批量操作，实在没有时间做浓度梯度摸索，建议稀释浓度略微少于说明书推荐的浓度）。

(5) 滴加反应增强液：滴加100μL或适量的反应增强液，37℃孵育20分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次（问：为什么要加反应增强液？答：一抗和抗原结合，信号不是特别稳定，这个时候，加入反应增强液，有助于加强一抗和抗原的结合信号，有利于下一步检测。问：反应增强液的主要成分是什么？答;一般是聚乙二醇，胶体金等。）

(6) 滴加增强酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物：滴加100μL或适量的增强酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物，37℃孵育20分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。（问：增强酶指的是什么？答：一般指的是HRP或AP，市面上出售的，大部分是HRP）

(7) DAB显色：加入适量新鲜配制的DAB或AEC显色液，室温孵育5～8分钟。（问：DAB显色盒子，一般有几种组分？（答：主要是两种，一种是DAB显色液，简称A试剂，另一种是30%过氧化氢，简称B试剂，由于过氧化氢不稳定，所以DAB显色液，一般要求提前配制，避光保存，短时间使用完毕）

(8) 复染：自来水冲洗，苏木素染色液孵育20秒；分化、冲洗返蓝，必要时DAPI染细胞核。 （问：免疫组化为什么要复染？答：主要是为了镜下观察方便，复染，主要染细胞核，细胞核蓝紫色，其他阳性反应为棕褐色。问：什么时候用DAPI染色？答：DAPI能够和细胞核中的DNA结合，发出荧光，主要用于免疫荧光染色。）

(9) 脱水：切片依次加入下列试剂中： 50%乙醇1～2分钟 → 70%乙醇1～2分钟→ 95%乙醇1～2分钟→ 95%乙醇1～2分钟→ 无水乙醇1～2分钟→ 无水乙醇1～2分钟（ 问：脱水和水化什么区别？答：脱水和水化相反，水化从高浓度开始，脱水从低浓度开始，目的是脱去组织中的水分子，以利于长久保存）。

(10) 透明：切片放入二甲苯中，5分钟左右使之透明化（问：免疫组化中，有三次用到二甲苯，一次是蜡块包埋前，一次是脱蜡时，一次是染色后，这三次，目的有何不同？答：第一次使用二甲苯，是利用二甲苯既能溶于乙醇，又能溶解石蜡，目的是石蜡充分浸入组织；第二次，使用二甲苯，是让二甲苯进入组织，使组织透明，更有利于观察）。

(11) 封片：中性树胶滴一点于载玻片上，用盖玻片，轻轻压住，封好的组织切片，放入超净台中，打开抽风，抽几分钟，然后切片晾干，就可永久保存了。

(12) 阅片：

(13) 图片定量分析：常用ImageJ软件对图像进行分析（简单介绍;ImageJ是美国NIH开发的，非常强大的软件，做生命科学研究，不使用软件是不行的。）

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