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荧光定量PCR的关键分子:设计巧妙的抗体修饰的热启动DNA聚合酶
来源:www.bjhhtx.com | 作者:瀚海拓新 | 发布时间: 2024-09-18 | 453 次浏览 | 分享到:
众所周知,做分子的离不开酶,做蛋白的离不开抗体。比如,普通PCR,我们选用Taq酶;
高保真PCR,我们选用pfu酶;那么荧光定量PCR,我们又该选用什么样的酶?
荧光定量,极其灵敏,理论上可以检测单细胞的基因水平,少至1个拷贝的DNA差异,也能被检测出来,选择什么样的酶可以满足这个要求呢?

众所周知,做分子的离不开酶,做蛋白的离不开抗体。

比如,普通PCR,我们选用Taq酶;

高保真PCR,我们选用pfu酶;

那么荧光定量PCR,我们又该选用什么样的酶?

荧光定量,极其灵敏,理论上可以检测单细胞的基因水平,少至1个拷贝的DNA差异,也能被检测出来。

孔子说过,“物极必反”,一个技术,太灵敏了,也不是个好事。

太灵敏了,一个微小的差异,就会导致一个较大的改变。

比如低温条件下,由引物二聚体引起的非特异性扩增,普通PCR,就不是一个事儿,但在敏感的荧光定量面前,就足以引起统计学意义上的改变。

做荧光定量,首先得有荧光定量PCR仪。

这个仪器出现,也是依赖物理学技术进步。荧光报告基团,能够荧光定量PCR仪光源激发,机器能够实时采集信号强度

但是,有了科研设备,也不是万事大吉了。

没有配套设备的试剂出来,设备也只能是皇宫里的太监-中看不中用。

开发试剂,就面临一个问题,选择什么样酶?

我们起初选择传统的Taq酶和pfu酶,但我们发现,由于其高灵敏性,非特异性扩增也被检测出来了。

那么,我们下意识想,能不能再找到另外一个酶?

前面文章介绍到,Taq酶和pfu酶的发现,充满了幸运和坎坷(天鹅都是白色吗,蛋白质高温就会失活吗?Taq 酶就是要与众不同!——长片段高保真PCR的首选-Pfu酶),另起炉灶,重新寻找一个酶,谈何容易!

既然从头再来做不到,我们只能在原来基础上加以改进。

我们试着对传统酶做分子修饰,做结构改良,结果要么是活性被抑制,要么是非特异扩增照样出现。

这个时候,有天才科学家,跳出对分子本身修饰的惯性思维,想出来一个绝妙天才方案:

他把一个抗Taq单克隆抗体和Taq酶混合到了一起,组成混合物,低温条件下,抗体和酶紧紧结合在一起,酶的活性位点被掩盖,酶的活性被抑制;高温条件下,抗体和酶分离,酶的活性位点暴露,酶的活性被激发。

这就是抗体修饰热启动酶。

我看完这个设计,觉得真牛逼, 科研不是非要高大上,一个小小的改进就能促进大大的进步。

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